5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Nru tal-qattus: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) hija taħlita ta 'sonda waħda ta' tubu stabbli ħafna adattata għal traskrizzjoni inversa f'pass wieħed u PCR kwantitattiv (qRT-PCR).Jappoġġja t-taħlit minn qabel ta 'primers u sondi u jibqa' stabbli wara ħażna għal żmien twil f'temperatura baxxa.Il-kampjun li għandu jiġi ttestjat jista 'jiġi miżjud direttament meta jintuża, mingħajr operazzjoni addizzjonali ta' ftuħ ta 'tubu/pipettar.Dan il-prodott jipprovdi komponenti, eż. DNA polymerase hot-start, M-MLV, uracil DNA glycosylase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTPs (b'dUTP minflok dTTP), u stabilizzaturi.Bl-amplifikazzjoni rapida reverse transcriptase u DNA polymerase modifikati ġenetikament, huwa possibbli li titlesta l-amplifikazzjoni PCR fi żmien 20-40 minuta.Dan ir-reaġent juża buffer speċjali għal qPCR b'enzimi mħallta ta 'enzima ta' amplifikazzjoni anti-inibitorja u enzima UNG.Għalhekk, jista 'jikseb amplifikazzjoni tajba tal-ġeni fil-mira u jipprevjeni amplifikazzjoni falza kkawżata minn residwu tal-PCR u tniġġis tal-ajrusol.Dan ir-reaġent huwa kompatibbli mal-biċċa l-kbira tal-istrumenti PCR kwantitattivi tal-fluworexxenza minn manifatturi bħal Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad u Roche.
Komponent
1.25 × Neoscript Fast RTase/UNG Taħlita
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Kundizzjonijiet tal-Ħażna
Il-komponenti kollha għandhom jinżammu f'-20℃ għal ħażna fit-tul u 4℃ sa 3 xhur.Jekk jogħġbok ħallat sewwa wara li tinħall u ċċentrifuga qabel tuża.Evita l-iffriżar u t-tidwib frekwenti.
Preparazzjoni tas-Sistema ta' Reazzjoni qRT-PCR
| Komponenti | 25μLSistema | 50μLSistema | Konċentrazzjoni Finali |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25 × Neoscript Fast RTase/UNG Taħlita | 1μL | 2μL | 1× |
| 25 × Taħlita tal-Primer-Probea | 1μL | 2μL | 1× |
| Mudell RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Sa 25μL | Sa 50μL | – |
1) a.Il-konċentrazzjoni finali tal-primer hija ġeneralment 0.2μM.Għal riżultati aħjar, il-konċentrazzjoni tal-primer tista 'tiġi ottimizzata fil-medda ta' 0.2-1μM.Ġeneralment, il-konċentrazzjoni tas-sonda tista 'tiġi ottimizzata fil-medda ta' 0.1-0.3μM.
2) b.Meta tuża Proċedura ta 'PCR veloċi, iż-żieda tal-konċentrazzjoni ta' primers u sondi tista 'tirriżulta f'riżultati ta' amplifikazzjoni aħjar, u l-proporzjon tagħhom għandu jiġi ottimizzat kif xieraq.
3) Tipi differenti ta 'kampjuni fihom tipi differenti u kontenut ta' inibitur u numru ta 'kopja tal-ġene fil-mira.Il-volum tal-kampjun għandu jiġi kkunsidrat mill-kondizzjoni attwali.Agħmel dilwizzjoni tal-kampjun b'ilma mingħajr nukleażi jew TE Buffer, jekk meħtieġ.
Reazzjoni Ċkondizzjonijiet
| Proċedura PCR Regolari | Proċedura rapida tal-PCR | ||||||
| Proċedura | Temp. | Ħin | Ċiklu | Proċedura | Temp. | Ħin | Ċiklu |
| Traskrizzjoni Reverse | 50℃ | 10-20 minuta | 1 | Traskrizzjoni Reverse | 50℃ | 5mins | 1 |
| Polimerażi Attivazzjoni | 95℃ | 1-5 minuti | 1 | Polimerażi Attivazzjoni | 95℃ | 30s | 1 |
| Denaturazzjoni | 95℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturazzjoni | 95℃ | 1-3s | 40-50 |
| Ittemprar u Estensjoni | 56-64℃ | 20-60s | Ittemprar u Estensjoni | 56-64℃ | 3-20s | ||
Kontroll tal-Kwalità
1.Sejbien tal-funzjoni: sensittività, speċifiċità u ripetibbiltà tal-qPCR.
2.L-ebda attività nukleażi eżoġena: l-ebda tniġġis eżoġenu ta 'endonuclease u exonuclease.
Noti
1.Ir-rata ta 'amplifikazzjoni tad-DNA polimerażi mgħaġġla hija mhux inqas minn 1kb/10s.Strumenti differenti tal-PCR għandhom veloċitajiet differenti ta 'tisħin u tkessiħ, modi ta' kontroll tat-temperatura u konduttività termali, u għalhekk l-ottimizzazzjoni tal-konċentrazzjoni tal-primer/sonda tiegħek u l-metodu ta 'tħaddim flimkien mal-istrument tal-PCR mgħaġġel speċifiku tiegħek hija essenzjali.
2.Dan il-prodott iwettaq applikabilità wiesgħa, u huwa adattat għal dijanjosi molekulari ta 'sensittività għolja.Il-metodu PCR fi tliet stadji huwa rrakkomandat għal primers b'temperatura ta 'ttemprar baxxa jew għall-amplifikazzjoni ta' frammenti twal ta 'aktar minn 200 bp.
3.Peress li amplicons differenti għandhom effiċjenza ta 'utilizzazzjoni differenti ta' dUTP u sensittività differenti għal UNG, ir-reaġenti għandhom jiġu ottimizzati jekk is-sensittività ta 'skoperta tonqos meta tuża s-sistema UNG.Jekk jogħġbok ikkuntattjana għal appoġġ tekniku jekk meħtieġ.
4.Biex tiġi evitata l-amplifikazzjoni tal-prodotti PCR tal-ġarr, huma meħtieġa żona sperimentali u pipetta ddedikata għall-amplifikazzjoni.Oħdem bl-ingwanti u ibdel ta 'spiss u ma tiftaħx it-tubu tal-PCR wara l-amplifikazzjoni.
