M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase tinkiseb permezz tat-teknoloġija tal-inġinerija ġenetika.Għandu kapaċità ogħla ta 'sintesi ta' cDNA, stabbiltà termali u limitu ta 'temperatura ta' reazzjoni (sa 60 ° C).Il-prodott cDNA sintetizzat huwa sa 10 kb.Ittejjeb l-affinità tal-mudelli u hija adattata għat-traskrizzjoni inversa ta 'mudelli RNA bi struttura sekondarja kumplessa jew ġeni ta' kopja baxxa.
Komponenti
| Komponent | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 mL | 5 mL |
Kundizzjoni tal-Ħażna
Dan il-prodott għandu jinħażen f'-25°C~-15°C għal sentejn.
Definizzjoni ta' Unità
Unità waħda tinkorpora 1 nmol ta 'dTTP f'materjal li ma jinħallx fl-aċidu f'10 minuti f'37 ° C billi tuża Oligo(dT) bħala primers.
Setup tar-Reazzjoni
1.Denaturazzjoni tal-mudell tal-RNA (Dan il-pass huwa fakultattiv, id-denaturazzjoni tal-mudell tal-RNA tgħin biex jinfetħu l-istrutturi sekondarji, li jtejbu r-rendiment tal-ewwel linja cDNA.)
| Komponenti | Volum (μL) |
| RNase ħielsa ddH2O | Sa 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) jew Primer Random (50 μmol/L) Jew Primers Speċifiċi tal-Ġene (2 μmol/L) | 1 |
| jew 1 | |
| jew 1 | |
| Mudell tal-RNA | X a |
Noti:
1) a: RNA totali: 1-5 ug jew mRNA: 1-500 ng
2) Inkuba f'65 °C għal 5 minuti, imbagħad ittrasferixxi fuq is-silġ immedjatament biex tkessaħ għal 2 minuti.Ċentrifugazzjoni qasira biex tiġbor il-likwidu tar-reazzjoni, żid is-soluzzjoni tar-reazzjoni tat-traskrizzjoni inversa kif muri fit-tabella li ġejja.Pipetta bil-mod biex tħallat.
1.Preparazzjoni tat-taħlita ta' reazzjoni (volum ta' 20 μL)
| Komponenti | Volum (μL) |
| Taħlita tal-pass preċedenti | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| Ħallat dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inibitur RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Wettaq ir-reazzjoni taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin:
| Temperatura (°C) | Ħin |
| 25 °Ca | 5mins |
| 42 °Cb | 15-30 minuta |
| 85 °Cc | 5mins |
Noti:
1) a.L-inkubazzjoni f'25°C għal 5 minuti hija meħtieġa biss għall-użu tal-hexamers każwali.Jekk jogħġbok aqbeż dan il-pass meta tuża Oligo (dT)18jew Gene Specific Primer.
2) b.It-temperatura rakkomandata tat-traskrizzjoni inversa hija 42 ° C, Għal mudelli bi strutturi sekondarji kkumplikati jew kontenut għoli ta 'GC, huwa rakkomandat li tgħolli t-temperatura ta' reazzjoni għal 50-55 °C.
3) ċ.Tisħin f'85°C għal 5 minuti biex tiġi inattivata reverse transcriptase.
4) Il-prodott jista 'jintuża direttament f'reazzjonijiet PCR jew qPCR, jew maħżun f'-20 ° C għal ħażna għal żmien qasir.Huwa rakkomandat li aliguot il-prodotti u taħżen f'-80 ° C għal ħażna fit-tul.Evita l-iffriżar u t-tidwib frekwenti.
5) Il-prodott huwa adattat għal RT-qPCR f'pass wieħed, huwa rakkomandat li żżid 10-20 U reverse transcriptase għal kull sistema ta 'reazzjoni ta' 25μL, jew iżżid gradwalment l-ammont ta 'reverse transcriptase skont is-sitwazzjoni attwali.
Noti
1.Jekk jogħġbok żomm iż-żona sperimentali nadifa;Għandhom jintlibsu ingwanti u maskri nodfa waqt it-tħaddim.Il-konsumabbli kollha użati fl-esperiment għandhom ikunu ħielsa mill-RNase biex jipprevjenu l-kontaminazzjoni tal-RNase.
2.Il-proċeduri kollha għandhom isiru fuq is-silġ biex tiġi evitata d-degradazzjoni tal-RNA.
3.Kampjuni ta 'RNA ta' kwalità għolja huma rakkomandati biex jiżguraw effiċjenza għolja ta 'traskrizzjoni inversa.
4.Dan il-prodott huwa għal użu ta 'riċerka biss.
5.Jekk jogħġbok operat b'kowtijiet tal-laboratorju u ingwanti li jintremew, għas-sigurtà tiegħek.
