mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

L-mRNA Cap 2´ -O-methyltransferase kien derivat minn razza ta' E. coli rikombinanti li ġġorr il-ġene għall-mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase ta' vaccinia.Din l-enzima żżid grupp tal-metil fil-pożizzjoni 2'-O tal-ewwel nukleotide ħdejn l-istruttura tal-kappa fit-tarf 5' tal-RNA. -0) li tirriżulta fi struttura ta 'cap- 1.

L-istruttura Cap1 tista 'żżid l-effiċjenza tat-traduzzjoni, ittejjeb l-espressjoni ta' mRNA f'esperimenti ta 'trasfezzjoni u mikroinjezzjoni. Din l-enzima teħtieġ speċifikament RNA b'għatu m7GpppN bħala sottostrat.Ma jistax juża RNA b'pN, ppN, pppN jew GpppN fit-tarf 5'.RNA capped jista' jiġi ppreparat permezz ta' traskrizzjoni in vitro bl-użu ta' cap analog jew permezz ta' capping enżimatiku bl-użu ta' Vaccinia Capping Enzyme.

Komponenti

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × Capping Buffer ta 'Reazzjoni

Ħażna

-25 ～- 15 ℃ għall-ħażna (Evita ċikli ripetuti ta 'friża u tidwib)

Buffer tal-ħażna

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% gliċerol.

Definizzjoni ta' unità

Unità waħda hija definita bħala l-ammont ta' enzima meħtieġ biex titħallat 10 pmoles ta' traskrizzjoni ta' RNA b'kappa ta' 80 nt f'siegħa f'37°C.

Assays ta' kontroll tal-kwalità

Exonuclease:50U ta' mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase b'1μg λ-Hind III diġest DNA f'37 ℃ għal 16-il siegħa ma jagħti l-ebda degradazzjoni kif determinat mill-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose.

Endonukleażi: 50 U ta' mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase b'1 μg λDNA f'37℃ għal 16-il siegħa ma jagħtu l-ebda degradazzjoni kif determinat mill-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose.

Nickase: 50U ta' mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase b'1μg pBR322 f'37 ℃ għal 16-il siegħa ma jagħti l-ebda degradazzjoni kif determinat mill-elettroforeżi tal-ġel tal-agarose.

RNase: 50U ta' mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase b'1.6μg MS2 RNA għal 4 sigħat f'37℃ ma jagħti l-ebda degradazzjoni kif determinat mill-elettroforeżi tal-ġel agarose.

E. coli DNA: 50U ta' mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase jiġi skrinjat għall-preżenza ta'E. coli DNA genomic bl-użu taqMan qPCR ma primers speċifiċi għall-E. coli 16S locus rRNA.Il-E. coli il-kontaminazzjoni tad-DNA ġenomika hija =1E. coli ġenoma.

Batterjali Endotossina: LAL-test, skont l-edizzjoni tal-Farmakopea Ċiniża IV 2020, metodu tat-test tal-limitu tal-ġel, regola ġenerali (1143).Il-kontenut ta' endotossina batterjali għandu jkun =10 EU/mg.

Sistema ta' reazzjoni u kundizzjonijiet

1. Għaqqad ammont xieraq ta' Capped RNA u H2O mingħajr RNase f'tubu mikrofuġ ta' 1.5 mL għal volum finali ta' 16.0 µL.

2. Saħħan f'65℃ għal 5 minuti segwiti minn banju tas-silġ għal 5 minuti.

3. Żid il-komponenti li ġejjin fl-ordni speċifikata (għall-metilazzjoni ta' Capped RNA

inqas minn 10

* 10 × Buffer ta 'Reazzjoni ta' Capping : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Inkuba f'37℃ għal siegħa (2 sigħat ta 'inkubazzjoni huma rakkomandati għall-framment fil-mira ta' inqas minn 200 nt).

Applikazzjonijiet

Biex tittejjeb l-espressjoni ta 'mRNA waqt esperimenti ta' mikroinjezzjoni u trasfezzjoni.

Noti dwar l-użu

1. Qabel ir-reazzjoni, l-RNA għandu jiġi ppurifikat u maħlul f'ilma mingħajr nukleażi, is-soluzzjonijiet kollha m'għandux ikun fihom EDTA u joni.

2. Huwa rakkomandat li ssaħħan l-RNA tal-kampjun f'65℃ għal 5 min qabel ir-reazzjoni biex titneħħa l-istruttura sekondarja fit-tarf 5 tat-traskrizzjoni.Jista' jiġi estiż għal 10 min għal struttura kumplessa ta' 5 ´-terminal.