PNGase F
Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F) huwa l-aktar metodu enżimatiku effettiv biex jitneħħew kważi l-oligosakkaridi N-linked kollha mill-glikoproteini.PNGase F hija amidase, li tinqasam bejn l-aktar GlcNAc ta 'ġewwa u residwi ta' asparagine ta 'mannose għoli, ibridi, u oligosakkaridi kumplessi minn glikoproteini N-linked.
Applikazzjoni
Din l-enzima hija utli għat-tneħħija tar-residwi tal-karboidrati mill-proteini.
Preparazzjoni u speċifikazzjoni
| Dehra | Likwidu bla kulur |
| Purità tal-proteina | ≥95% (minn SDS-PAGE) |
| Attività | ≥500,000 U/mL |
| Exoglycosidase | L-ebda attività ma setgħet tiġi skoperta (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Proprjetajiet
| Numru tal-KE | 3.5.1.52(Rekombinanti minn mikro-organiżmu) |
| Piż molekulari | 35 kDa (SDS-PAĠNA) |
| Punt iżoelettriku | 8. 14 |
| pH ottimali | 7.0-8.0 |
| Temperatura ottima | 65 °C |
| Speċifiċità tas-sottostrat | Tkissir ta 'rabtiet glycosidic bejn GlcNAc u residwi ta' asparagine Fig.1 |
| Siti ta' rikonoxximent | N-linked glycans sakemm ma jkunx fihom α1-3 fucose Fig. 2 |
| Attivaturi | DTT |
| Inibitur | SDS |
| Temperatura tal-ħażna | -25 ~ -15 ℃ |
| Inattivazzjoni tas-Sħana | Taħlita ta’ reazzjoni ta’ 20µL li fiha 1µL ta’ PNGase F tiġi inattivata permezz ta’ inkubazzjoni f’75 °C għal 10 minuti. |
Fig. 1 L-ispeċifiċità tas-sottostrat ta PNGase F
Fig. 2 Is-sit ta’ rikonoxximent ta’ PNGase F.
Meta r-residwi interni ta 'GlcNAc huma marbuta ma' α1-3 fucose, PNGase F ma jistax jaqsam oligosaccharides N-linked minn glikoproteini.Din il-modifika hija komuni fil-pjanti u xi glikoproteini tal-insetti.
Componenti
|
| Komponenti | Konċentrazzjoni |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Glycoprotein Denaturating Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definizzjoni ta' unità
Unità(U) waħda hija definita bħala l-ammont ta' enzima meħtieġ biex jitneħħa >95% tal-karboidrat minn 10 µg ta' RNase B żnaturat f'siegħa f'37°C f'volum totali ta' reazzjoni ta' 10 µL.
Kundizzjonijiet ta' reazzjoni
1.Dewweb 1-20 µg ta’ glycoprotein b’ilma dejonizzat, żid 1 µl 10×Glycoprotein Denaturating Buffer u H2O (jekk meħtieġ) biex tagħmel volum ta’ reazzjoni totali ta’ 10 µl.
2.Inkuba f'100°C għal 10 min, kessaħ fuq is-silġ.
3.Żid 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 u ħawwad.
4.Żid 1-2 µl PNGase F u H2O (jekk meħtieġ) biex tagħmel volum ta' reazzjoni totali ta' 20 µl u ħawwad.
5.Inkuba reazzjoni f'37°C għal 60 min.
6.Għal analiżi SDS-PAGE jew analiżi HPLC.
