KIT ELISA ta' double-stranded RNA (dsRNA).

Dan il-kit huwa igganċjar ta 'Assaġġi Immunosorbenti Marbuta ma' Enżimi (ELISA) mas-sistema bijotina-Streptavidin, għal kejl kwantitattiv ta' dsRNA b'tul 'il fuq minn 60 pari bażi (bp), irrispettivament mis-sekwenza.Il-pjanċa ġiet miksija minn qabel b'antikorp anti-dsRNA.dsRNA preżenti fil-kampjun huwa miżjud u jingħaqad ma 'antikorpi miksija fuq il-bjar.U mbagħad jiżdied l-antikorp bijotinilat anti-dsRNA u jingħaqad mad-dsRNA fil-kampjun.Wara l-ħasil, HRP-Streptavidin huwa miżjud u jeħel mal-antikorp Biotinylated anti-dsRNA.Wara l-inkubazzjoni HRP-Streptavidin mhux marbut jinħasel.Imbagħad soluzzjoni tas-sottostrat TMB hija miżjuda u katalizzata minn HRP biex tipproduċi prodott ta 'kulur blu li nbidel f'isfar wara li żżid soluzzjoni ta' waqfien aċiduża.Id-densità ta 'l-isfar hija proporzjonali għall-ammont fil-mira ta' dsRNA maqbud fil-pjanċa.L-assorbanza hija mkejla f'450 nm.

Applikazzjoni

Dan il-kit huwa għall-kejl kwantitattiv tad-dsRNA residwu.

Komponenti tal-kit

Ħażna u Stabbiltà

1. Għal kit mhux użat: Il-kit kollu jista 'jinħażen f'2 ~ 8 ℃ fil-ħajja fuq l-ixkaffa.Dawl qawwi għandu jiġi evitat għall-istabbiltà tal-ħażna.

2. Għal kit użat: Ladarba jinfetaħ il-mikroplate, jekk jogħġbok ikopri bjar mhux użati b'sealer tal-pjanċa u erġa' lura fil-borża tal-fojl li fiha l-pakkett tad-dessikant, issiġilla b'żipp il-borża tal-fojl u erġa' lura għal 2 ~ 8 ℃ kemm jista 'jkun malajr wara l-użu.Reaġenti oħra għandhom jintbagħtu lura għal 2 ~ 8 ℃ kemm jista 'jkun malajr wara l-użu.

Materjali Meħtieġa Imma Mhux Fornuti

1. Microplate reader b'filtru ta '450±10nm (aħjar jekk jista' jiskopri f'wavelength ta '450 u 650 nm).

2. Microplate shaker.

3. Truf u tubi taċ-ċentrifugi mingħajr RNase.

Operazzjoni Flowchart

Qabel Tibda

1. Ġib il-komponenti u l-kampjuni kollha tal-kit għal temperatura tal-kamra (18-25℃) qabel l-użu.Jekk il-kit mhux se jintuża f'ħin wieħed, jekk jogħġbok oħroġ biss strixxi u reaġenti għall-esperiment preżenti, u ħalli l-istrixxi u r-reaġenti li jifdal f'kundizzjoni meħtieġa.

2. Buffer tal-ħasil: iddilwixxi 40mL ta '20x buffer tal-ħasil konċentrat b'760mL ta' ilma dejonizzat jew distillat biex tħejji 800mL ta '1x buffer tal-ħasil.

3. Standard: dawwar jew ċentrifuga fil-qosor is-soluzzjoni tal-istokk qabel l-użu.Il-konċentrazzjoni ta 'erba' standards provduti hija 5ng/μL.Għall-istandards UTP u pUTP dsRNA, jekk jogħġbok iddilwixxi s-soluzzjoni tal-istokk għal 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL bil-buffer STE biex tiġbed il-kurva standard.Għall-istandards N1-Me-pUTP dsRNA, jekk jogħġbok iddilwixxi s-soluzzjoni tal-istokk għal 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL bil-buffer STE biex tiġbed il-kurva standard.Għall-istandard 5-OMe-UTP dsRNA, jekk jogħġbok iddilwixxi s-soluzzjoni tal-istokk għal 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL bil-buffer STE biex tiġbed il-kurva standard.Nirrakkomandaw li l-istandards jistgħu jiġu dilwiti bħat-tabelli li ġejjin:

4. Antikorp ta 'sejbien bijotinilat u soluzzjoni ta' ħidma HRP-streptavidin: dawwar jew ċentrifuga fil-qosor is-soluzzjoni tal-istokk qabel l-użu.Iddilwixxihom sal-konċentrazzjoni tax-xogħol bil-buffer tad-dilwizzjoni.

5. Substate TMB: aspira d-dożaġġ meħtieġ tas-soluzzjoni b'ponot sterilizzati u terġax titfa' s-soluzzjoni residwa fil-kunjett.Is-sottostat TMB huwa sensittiv għad-dawl, ma esponiex is-sottostrat TMB għad-dawl għal żmien twil.

Bl-użu tal-protokoll

1. Iddetermina n-numru ta 'strixxi meħtieġa għall-assaġġ.Daħħal l-istrixxi fil-frejms għall-użu.Strixxi tal-pjanċi li jifdal mhux użati f'dan l-assaġġ għandhom jerġgħu jiġu ppakkjati fil-borża bid-dessikant.Agħlaq il-borża sewwa għall-ħażna fil-friġġ.

2. Żid 100μL kull waħda mid-dilwizzjonijiet ta' standard, blank u kampjuni fil-bjar xierqa.Għatti bis-sealer tal-pjanċa.Inkuba għal siegħa f'temperatura tal-kamra bi tħawwad f'500rpm.Il-kampjuni għandhom jiġu dilwiti b'STE buffer għal konċentrazzjoni xierqa għal analiżi preċiża.

3. Pass tal-ħasil: Aspira s-soluzzjoni u aħsel b'250μL buffer tal-ħasil għal kull bir u ħalliha toqgħod għal 30s.Armi l-buffer tal-ħasil kompletament billi taqbad il-pjanċa fuq karta assorbenti.Aħsel kompletament 4 darbiet.

4. Żid 100μL ta 'soluzzjoni ta' ħidma ta 'antikorp ta' detezzjoni bijotinilata f'kull bir.Għatti bis-sealer tal-pjanċa.Inkuba għal siegħa f'temperatura tal-kamra bi tħawwad f'500rpm.

5. Irrepeti l-pass tal-ħasil.

6. Żid 100μL ta 'soluzzjoni ta' ħidma HRP-streptavidin f'kull bir.Għatti bis-sealer tal-pjanċa.Inkuba għal 30min f'temperatura tal-kamra bi tħawwad f'500rpm.

7. Irrepeti l-pass tal-ħasil mill-ġdid.

8. Żid 100μL ta 'soluzzjoni ta' substrat TMB f'kull bir.Għatti bis-sealer tal-pjanċa.Inkuba għal 30 minuta f'RT Ipproteġi mid-dawl.Il-likwidu jdur blu biż-żieda ta 'soluzzjoni tas-sottostrat.

9. Żid 50μL ta' soluzzjoni ta' waqfien f'kull bir.Il-likwidu jsir isfar biż-żieda ta' soluzzjoni ta' waqfien.Imbagħad mexxi l-qarrej tal-mikroplate u wettaq kejl f'450nm immedjatament.

Kalkolu tar-Riżultati

1. Medja l-qari duplikat għal kull standard, kontroll, u kampjuni u naqqas id-densità ottika standard medja żero.Ibni kurva standard b'assorbiment fuq l-assi vertikali (Y) u konċentrazzjoni dsRNA fuq l-assi orizzontali (X).

2. Huwa rrakkomandat li jsir il-kalkolu b'softwer ta 'twaħħil tal-kurva bbażat fuq il-kompjuter bħal curve expert 1.3 jew ELISA Calc f'mudell ta' twaħħil mhux lineari ta '5 jew 4 parametri.

Prestazzjoni

1. Sensittività:

limitu aktar baxx ta 'skoperta: ≤ 0.001pg/μL (għal UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (għal 5-OMe-UTP-dsRNA).

limitu aktar baxx ta 'kwantifikazzjoni: 0.0156 pg/μL (għal UTP-, pUTP-dsRNA), 0.0312 pg/μL (għal N1-Me-pUTP-dsRNA), 0.0625 pg/μL (għal 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Preċiżjoni: CV ta 'Intra-Assay ≤10%, CV ta' Inter-Assay ≤10%

3. Irkupru: 80% ~ 120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(għal 5-OMe-UTP-dsRNA).

Konsiderazzjonijiet

1. It-temperatura u l-ħin tar-reazzjoni TMB huma kritiċi, jekk jogħġbok ikkontrollahom b'mod strett skond l-istruzzjoni.

2. Sabiex tinkiseb riproduċibilità u sensittività tajba tal-assaġġ, ħasil xieraq tal-pjanċi biex jitneħħew reaġenti żejda li ma rreaġixxewx huwa essenzjali.

3. Ir-reaġenti kollha għandhom jitħalltu sewwa qabel l-użu u jevitaw bumbles waqt iż-żieda tal-kampjun jew tar-reaġenti.

4. Jekk iffurmaw kristalli fil-buffer tal-ħasil konċentrat (20x), saħħan sa 37 ℃ u ħallat bil-mod sakemm il-kristalli jinħall kompletament.

5. Evita l-analiżi ta' kampjuni li fihom Sodium Azide (NaN3), peress li jista' jeqred l-attività HRP li tirriżulta f'sottovalutazzjoni tal-ammont ta' dsRNA.

6. Evita l-kontaminazzjoni RNase waqt l-assaġġ.

7. L-istandard/kampjun, l-antikorp ta 'skoperta u SA-HRP jistgħu wkoll isiru f'RT mingħajr tħawwad, iżda dan jista' jikkawża tnaqqis fis-sensittività ta 'skoperta b'darba waħda.Għal dan il-każ, nirrakkomandaw li l-istandards UTP u pUTP dsRNA għandhom jiġu dilwiti minn 2pg/μL, l-istandards N1-Me-pUTP dsRNA għandhom jiġu dilwiti minn 4pg/μL u l-istandard 5-OMe-UTP dsRNA għandu jiġi dilwit minn 8pg/μL.Barra minn hekk, inkuba soluzzjoni ta 'ħidma HRP-streptavidin għal 60 minuta f'temperatura tal-kamra.Tużax flask shaker, minħabba li flask shaker jista' jirriżulta f'riżultat mhux preċiż.

Riżultat tipiku

1. Dejta tal-kurva standard

2. Kalkolu tal-kurva standard

3. Firxa ta 'skoperta tal-inforra: 0.0312- 1pg/μL