EndoFree Plasmid Maxi Kit
Dan il-kit huwa adattat għall-estrazzjoni minn 150 – 300 ml ta 'soluzzjoni batterjali kkultivata matul il-lejl, bl-użu ta' metodu mtejjeb ta 'liżi SDS-alkaline biex lyse l-batterja.L-estratt mhux raffinat huwa kkombinat b'mod selettiv ma 'Endotoxin Scavenger uniku u separat permezz ta' ċentrifugazzjoni biex jitneħħew l-endotossini.Imbagħad, il-membrana tal-ġel tas-silika tingħaqad b'mod selettiv mad-DNA tal-plasmid fis-soluzzjoni taħt kundizzjonijiet ta 'melħ għoli u pH baxx.Dan huwa segwit biż-żieda ta' buffer tal-ħasil biex jitneħħew l-impuritajiet u komponenti batterjali oħra.Fl-aħħarnett, buffer ta 'eluzzjoni b'livell baxx ta' melħ u pH għoli huwa użat biex elużjoni DNA tal-plasmid pur mill-membrana tal-matriċi tas-silikon.Il-membrana tal-ġel tas-silika timpjega membrana ta 'adsorbiment speċjali, u d-differenza fl-ammont ta' adsorbiment bejn il-kolonna u l-kolonna hija żgħira ħafna u r-ripetibbiltà hija tajba.Fenol, kloroform u reaġenti tossiċi oħra mhumiex meħtieġa, u lanqas il-passi ta 'preċipitazzjoni ta' l-etanol.Dan il-kit jista 'jintuża biex jiġi estratt malajr 0.2 -1.5 mg ta' DNA plasmid pur b'kopja għolja, b'rata ta 'estrazzjoni ta' 80% -90%.Il-kit juża formula ta 'proċess uniku jneħħi l-endotossina, il-kontenut ta' endotossina huwa estremament baxx u l-effett tat-trasfezzjoni taċ-ċelluli huwa eċċellenti.Il-plasmid estratt jista 'jintuża direttament fid-diġestjoni ta' l-enżimi, PCR, traskrizzjoni in vitro, trasformazzjoni, sekwenzar u esperimenti oħra ta 'bijoloġija molekulari.
Kundizzjonijiet tal-ħażna
RNaseA għandu jinħażen f'-30 ~ -15 ℃ u ttrasportat f'≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger jista 'jinħażen f'2 ~ 8 ℃ għal xahar, maħżun fi -30 ~ -15 ℃ għal ħażna fit-tulu ttrasportati f'≤0℃.
Komponenti oħra għandhom jinħażnu f'temperatura tal-kamra (15 ~ 25 ℃) u ttrasportati f'temperatura tal-kamra.
Komponenti
| Komponenti | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| Kolonni FastPure DNA Maxi ( Kull wieħed f'Tubu tal-Ġbir ta' 50ml) | 10 |
| Tubu tal-Ġbir mingħajr Endotossini | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, użata biex tneħħi l-RNA.
Buffer P1:buffer ta' sospensjoni batterjali, żid RNaseA ma' Buffer P1 qabel l-ewwel użu.
Buffer P2:buffer tal-liżi batterjali (li fih SDS/NaOH).
Buffer P4:buffer newtralizzanti.
Endotoxin Scavenger:neħħi b'mod effettiv l-endotossina mill-estratt tal-plasmid mhux raffinat.
Buffer PW:buffer tal-ħasil, żid il-volum stipulat ta 'etanol qabel l-ewwel użu.
Buffer TB:buffer tal-eluzzjoni.
Kolonni FastPure DNA Maxi:kolonni ta' assorbiment tad-DNA tal-plasmid.
Tubi tal-Ġbir 50 ml:tubi tal-ġbir tal-filtrat.
Tubu tal-Ġbir mingħajr Endotossini:tubi tal-ġbir tad-DNA tal-plasmid.
Materjali ppreparati
Etanol assolut, isopropanol, 50 ml tubi ċentrifugi bil-qiegħ tond u 50 ml ħielsa minn endotossinitubi ċentrifugi.
Applikazzjonijiet
Dan il-prodott huwa adattat għall-estrazzjoni fuq skala kbira ta 'plażmidi minn 150 - 300 ml ta' soluzzjoni batterjaliikkultivata matul il-lejl.
Proċess ta 'Esperiment
1. Ħu 150 – 200 ml (mhux aktar minn 300 ml) ta’ soluzzjoni batterika kkultivata matul il-lejl u ċċentrifuga f’madwar 11,000 rpm (12,000 × g) għal 1 – 2 min.Armi s-supernatant u iġbor batterji.
Δ Meta tiġbor aktar minn 50 ml ta 'soluzzjoni batterjali, il-batterja tista' tinġabar billi żżid soluzzjoni batterika, ċentrifugazzjoni, twarrab is-supernatant u passi oħra fl-istess tubu ta '50 ml għal
diversi drabi.
2. Żid 7.5 ml ta’ Buffer P1 (jekk jogħġbok iċċekkja jekk RNaseA ġiex miżjud mal-Buffer P1) fiċ-ċentrifugatubu li jkun fih il-batterja u ħallat sewwa permezz ta' vortex jew pipetta.
Δ Is-sospensjoni sħiħa tal-batterja f'dan il-pass hija kritika biex tagħti, u m'għandux ikun hemm ċapep batterjali wara s-sospensjoni mill-ġdid.Jekk ikun hemm ċapep batterjali li mhumiex imħallta sewwa, se taffettwa l-liżi, li tirriżulta f'rendiment baxx u purità.Jekk l-OD600 ta 'soluzzjoni batterjali hija 0.65, huwa rakkomandat li jintużaw 7.5 ml ta' Buffer P1 meta jiġu estratti minn 150 ml ta 'soluzzjoni batterjali;meta OD600 huwa 0.75, għandhom jintużaw 8 ml ta 'Buffer P1 u l-volumi ta' Buffers P2 u P4 għandhom jinbidlu kif xieraq.Jekk il-volum tas-soluzzjoni batterjali jiżdied għal 200 ml, huwa rakkomandat li l-volum tal-Buffers P1, P2, u P4 jiżdied proporzjonalment.
3. Żid 7.5 ml ta' Buffer P2 mas-sospensjoni batterika mill-pass 2 u ħawwad bil-mod 'l fuq u' l isfel għal 6 – 8darbiet u inkuba f'temperatura tal-kamra għal 4 – 5 min.
Δ Aqleb bil-mod biex tħallat sewwa.Vortexing se jikkawża l-frammentazzjoni tad-DNA ġenomika, li tirriżulta fi frammenti tad-DNA ġenomika fil-plasmid estratt.F'dan iż-żmien, is-soluzzjoni ssir viskuża u trasluċida, li turi li l-batterji ġew lisati għal kollox.It-tul m'għandux jaqbeż il-5 minuti biex tiġi evitata l-qerda tal-plażmidi.Jekk is-soluzzjoni ma tkunx ċara, jista 'jkun hemm wisq batterji li jirriżultawliżi mhux kompluta, għalhekk l-ammont ta 'batterji għandu jitnaqqas b'mod xieraq.
4. Żid 7.5 ml ta' Buffer P4 mas-sospensjoni batterika mill-pass 3 u immedjatament aqleb bil-mod 6 – 8 darbiet biex is-soluzzjoni tkun tista' tinnewtralizza kompletament Buffer P2.F'dan iż-żmien, għandu jidher preċipitat flocculent abjad.Iċċentrifuga f'aktar minn madwar 11,000 rpm (12,000 × g) għal 10 – 15-il minuta, b'pippet bir-reqqa s-supernatant f'tubu ċentrifugu ġdid ta' 50 ml bil-qiegħ tond (ppreparat waħdu), u evitaaspira l-preċipitat abjad li jżomm f'wiċċ l-ilma.
Δ Żid Buffer P4 u immedjatament aqleb biex tħallat sew.Ħalli t-tubu joqgħod sakemm il-preċipitat abjad jitqassam b'mod uniformi fis-soluzzjoni kollha biex tevita l-produzzjoni ta' preċipitazzjoni lokali li tista' taffettwa n-newtralizzazzjoni.Jekk ma jkun hemm l-ebda preċipitat flocculent abjad uniformi qabel iċ-ċentrifugazzjoni u s-supernatant ma jkunx ċar wara ċ-ċentrifugazzjoni, it-tubu jista 'jkunċentrifugat għal 5 minuti oħra.
5. Żid 0. 1 darbiet il-volum (10% tal-volum supernatant, madwar 2.2 ml) ta' Endotoxin Scavenger mas-supernatant mill-pass 4 u aqleb biex tħallat.Poġġi s-soluzzjoni f'banju tas-silġ jew daħħal fis-silġ imfarrak (jew friġġ fil-friża) għal 5 minuti sakemm is-soluzzjoni tinbidel minn imdardra għal ċara u trasparenti (jew xorta waħda.kemmxejn imdardra), u kultant ħallat diversi drabi.
Δ Wara li l-Endotoxin Scavenger jiġi miżjud mas-supernatant, is-supernatant isir imdardra iżda l-is-supernatant għandu jsir ċar (jew kemmxejn imdardar) wara t-tkessiħ fil-banju tas-silġ.
6. Wara li s-supernatant jitqiegħed f'temperatura tal-kamra (> 25 ℃) għal 10 – 15-il minuta, isir imdardra hekk kifit-temperatura tiegħu tiżdied għat-temperatura tal-kamra.Imbagħad is-supernatant għandu jiġi maqlub biex jitħallat.
Δ Jekk it-temperatura tal-kamra hija aktar baxxa jew trid tnaqqas il-ħin ta 'estrazzjoni, is-supernatant jista' jiġi inkubat f'banju ta 'l-ilma ta' 37 ~ 42 ℃ għal 5 - 10 minuti u l-pass li jmiss jista 'jsir wara s-supernatant.isir imdardra.
7. Iċċentrifuga s-supernatant f'madwar 11,000 rpm (12,000 × g) għal 10 min f'temperatura tal-kamra (it-temperatura trid tkun > 25 ℃) biex tissepara l-fażi.Il-fażi milwiema ta 'fuq fiha d-DNA filwaqt li s-saff tal-fażi żejtnija blu t'isfel fih endotossina u impuritajiet oħra.Ittrasferixxi l-Fażi milwiema li fiha DNA għal tubu ġdid uarmi s-saff żejtni.
Δ It-temperatura waqt iċ-ċentrifugazzjoni għandha tkun aktar minn 25 ℃ peress li s-separazzjoni effettiva tal-fażi ma tagħmilx hekkiseħħ jekk it-temperatura tkun baxxa wisq.
Δ Jekk is-separazzjoni tal-fażi mhix effettiva, it-temperatura taċ-ċentrifugazzjoni tista 'tiġi aġġustata għal 30℃ uil-ħin taċ-ċentrifugazzjoni jista 'jiżdied għal 15-il minuta.
Δ Terdax is-saff żejtni blu peress li fih endotossina u impuritajiet oħra.
Mekkaniżmu
Newtralizzazzjoni tal-Liżi ta' Suspensjoni mill-ġdid
◇ Żid 7.5 ml Buffer P1
◇ Żid 7.5 ml Buffer P2
◇ Żid 7.5 ml Buffer P4
Tneħħija ta' endotossini
◇Żid 0. 1 darbiet il-volum ta 'supernatant ta' Endotoxin Scavenger
Irbit u Ħasil
◇ Żid 0.5 darbiet il-volum ta 'isopropanol
◇ Żid 10 ml Buffer PW
◇ Żid 10 ml Buffer PW
Elużjoni
◇ Żid 1 – 2 ml Buffer TB jew ddH2O mingħajr Endotossini
