Mini Kit ta' Estrazzjoni tad-DNA
Dan il-kit jadotta sistema ta 'buffer ottimizzata u teknoloġija ta' purifikazzjoni tal-kolonna tal-ġel tas-silika, li tista 'tirkupra frammenti tad-DNA ta' 70 bp - 20 kb minn konċentrazzjonijiet varji ta 'ġel agarose TAE jew TBE.Il-kolonna ta 'assorbiment tad-DNA tista' tadsorbi d-DNA b'mod speċjali taħt kundizzjoni ta 'melħ għoli.Barra minn hekk, il-kit jista 'jippurifika direttament frammenti tad-DNA minn prodotti PCR, sistemi ta' reazzjoni enżimatiċi jew prodotti tad-DNA mhux raffinati miksuba b'metodi oħra, u jneħħi impuritajiet bħal proteini, komposti organiċi oħra, jonji tal-melħ inorganiċi u primers oligonukleotidi.Jista 'jiżgura li l-purifikazzjoni tista' titlesta fi żmien 10-15-il minuta.Id-DNA purifikat jista 'jintuża direttament għal ligazzjoni, trasformazzjoni, diġestjoni ta' enzimi, traskrizzjoni in vitro, PCR, sekwenzar, mikroinjezzjoni, eċċ.
Kundizzjonijiet tal-ħażna
Aħżen f'-15 ~ -25 ℃ u ttrasporta f'temperatura tal-kamra.
Komponenti
| Komponenti | (100 rxns) |
| PGD ta' lqugħ | 80 ml |
| Buffer GW | 2 × 20 ml |
| Buffer tal-Eluzzjoni | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Kolonni-G | 100 |
PGD tal-bafer:buffer li jgħaqqad id-DNA.
Buffer GW:Buffer tal-ħasil;żid etanol assolut bil-volum indikat fuq il-flixkun qabel l-użu.
Buffer tal-Eluzzjoni:Elużjoni.
FastPure DNA Mini Kolonni-G:Kolonni ta' assorbiment tad-DNA.
Tubi tal-Ġbir 2 ml:Tubi tal-ġbir għall-filtrat.
Materjali ppreparati
1.5 ml tubi sterilizzati, etanol assolut u isopropanol (meta framment tad-DNA ≤100 bp, żid volum 1
isopropanol għal ġel ta 'volum 1), banju ta' l-ilma.
Proċess ta 'Esperiment
Żid 80 ml ta' etanol biex iddilwa Buffer GW kif indikat fuq it-tikketta qabel l-użu, aħżen f'temperatura tal-kamra.
Mekkaniżmu
1. Soluzzjoni ta' reazzjoni PCR
Skema ta' estrazzjoni tal-ġel: Żid volum ugwali Buffer GDP Skema ta' rkupru tas-soluzzjoni ta' reazzjoni PCR:Żid 5 darbiet il-Buffer tal-volum
2. PGD Ikkalkula l-volum tal-ġel (100 μl hija ugwali għal 100 mg)
Ħoll il-ġell
3. Saħħan minn qabel f'50 ~ 55℃
4. Bind Aħsel
Żid 300 μL ta' Buffer GDP*
Żid 700 μL ta' Buffer GW
Żid 700 μL ta' Buffer GW
5. Elute
Żid 20 – 30μL ta’ Elution Buffer jew ilma dejonizzat
Noti* Irkupru tal-fluwidu tar-reazzjoni tal-PCR mingħajr dan il-pass
Programm ta 'estrazzjoni tal-ġel
1. Wara l-elettroforeżi tad-DNA għall-frazzjonar tal-frammenti tad-DNA, is-sisa tal-istrixxa waħda tal-framment tad-DNA mill-ġell tal-agarose taħt dawl UV.Huwa rakkomandat li tuża karta assorbenti biex tassorbi l-umdità apparenti tal-ġel u timminimizza d-daqs tal-porzjon tal-ġel billi tneħħi l-agarose żejjed kemm jista 'jkun.Iżen il-porzjon tal-ġel (mingħajr tubu mikroċentrifugu) biex tikkalkula l-volum tagħha: Il-volum ta '100 mg porzjon tal-ġell huwa madwar 100 μL, jekk wieħed jassumi li d-densità hija 1g/ml.
2. Żid volum ugwali Buffer GDP, inkuba f'50 ~ 55 ℃ għal 7-10 min (skond id-daqs tal-ġel, aġġusta l-ħin ta 'inkubazzjoni sakemm il-ġell jinħall kompletament).Aqleb it-tubu 2 darbiet matul l-inkubazzjoni.
Δ Żieda ta '1-3 volumi ta' Buffer GDP mhux se jinfluwenza l-effiċjenza tal-irkupru tad-DNA.Jekk il-framment tad-DNA li jrid jiġi rkuprat <100 bp, jeħtieġ li jiżdiedu 3 volumi ta' Buffer GDP;meta l-porzjon tal-ġell ikun inħall kompletament, żid volum 1 ta 'isopropanol u ħawwad sewwa, imbagħad kompli għall-pass li jmiss.
3. Iċċentrifuga fil-qosor biex tressaq il-kampjun fil-qiegħ tat-tubu, daħħal il-FastPure DNA Mini Columns-G fit-Tubi tal-Ġbir 2 ml, ittrasferixxi b'attenzjoni s-soluzzjoni massimu ta' 700 μL darba kull
ħin għall-kolonni tal-filtrazzjoni, ċentrifuga fi 12,000 rpm (13,800 X g) għal 30-60 sek.
4. Armi l-filtrat u żid 300 μL ta' Buffer GDP mal-kolonna, inkuba f'temperatura tal-kamra għal 1 min, ċentrifuga fi 12,000 rpm (13,800 X g) għal 30-60 sek.
5. Armi l-filtrat u żid 700 μL ta’ Buffer GW (iċċekkja jekk etanol assolut ġiex miżjud bil-quddiem!) fil-kolonna, ċentrifuga fi 12,000 rpm (13,800 X g) għal 30-60 sek.
Δ Jekk jogħġbok żid Buffer GW madwar il-ħajt tal-kolonna tal-adsorbiment, jew żid il-qoxra ta 'wara tal-Buffer GW u ħallat rasu 'l isfel għal 2 - 3 darbiet biex tgħin biex tlaħlaħ kompletament il-melħ li jeħel mal-ħajt tat-tubu.
6. Irrepeti l-pass 5.
Δ Il-flushing b'Buffer GW darbtejn jista 'jiżgura li l-melħ jitneħħa kompletament u jelimina l-impatt fuq esperimenti sussegwenti.
7. Armi l-filtrat u ċċentrifuga l-kolonna vojta fi 12,000 rpm (13,800 X g) għal 2 min.
8. Daħħal il-kolonna f'tubu mikroċentrifugu nadif ta' 1.5 ml, żid 20 - 30 μL ta' Elution Buffer fiċ-ċentru tal-membrana tal-kolonna, inkuba għal 2 min, u mbagħad ċentrifuga f'12,000 rpm (13,800 X g) għal 1 min.Armi l-kolonna, aħżen id-DNA miksuba f'-20.
Δ It-trasferiment tas-supernatant tal-pass 8 għall-kolonna biex jerġa' jeħles u ssaħħan minn qabel il-Elution Buffer għal 55 (meta framment tad-DNA >3 kb) forsi ta' għajnuna biex tiżdied l-effiċjenza tal-irkupru.
Programm ta' rkupru ta' prodotti PCR
Dan il-protokoll huwa applikabbli biex jippurifika frammenti tad-DNA minn prodotti PCR, sistema ta 'reazzjoni enżimatika u prodotti oħra tad-DNA mhux raffinati (inkluż DNA ġenetiku).Din is-soluzzjoni tista 'tneħħi b'mod effiċjenti diversi nukleotidi, primers, primer dimers, molekuli tal-melħ, enżimi u impuritajiet oħra.
1. Iċċentrifuga fil-qosor prodotti tal-PCR, soluzzjoni ta 'reazzjoni enżimatika, u prodotti oħra tad-DNA mhux raffinati.Stima l-volum tagħhom bil-pipetta u ttrasferixxi għal tubu sterilizzat ta’ 1.5 ml jew 2 ml.Żid ddH2O sakemm il-volum sa 100 μL;filwaqt li għad-DNA ġenomika b'konċentrazzjoni għolja, id-dilwizzjoni għal 300 μL b'ddH2O tgħin biex ittejjeb l-effiċjenza tal-irkupru.
2. Żid 5 volumi ta' Buffer GDP, ħawwad sewwa billi taqleb jew ħawwad b'vortex.Jekk il-framment tad-DNA ta' interess >100 bp, jeħtieġ li jiżdiedu 1.5 volumi addizzjonali (kampjuni + Buffer GDP) ta' etanol.
3. Daħħal il-kolonna lura fit-tubu tal-ġbir, ittrasferixxi t-taħlita vera għall-kolonna, ċentrifuga f'12,000 rpm (13,800 ×g) għal 30 – 60 sek.Jekk il-volum tas-soluzzjoni mħallta huwa > 700 µL, poġġi l-kolonna tal-adsorbiment lura fit-tubu tal-ġbir, ittrasferixxi s-soluzzjoni li jifdal fil-kolonna tal-adsorbiment, u ċċentrifuga f'12,000 rpm (13,800 × g) għal 30 – 60 sek.
4. Il-prestazzjoni li jmiss tirreferi għall-pass 5 – 8 tal-programm ta 'estrazzjoni 08- 1/Gel.
Applikazzjonijiet
Diversi konċentrazzjonijiet ta 'ġel agarose TAE jew TBE;Prodotti tal-PCR, sistemi ta' reazzjoni enżimatika jew prodotti oħra tad-DNA mhux raffinati miksuba b'diversi metodi.Frammenti rkuprati varjaw minn70 bp -20 kb.
Noti
Għall-użu tar-riċerka biss.Mhux għall-użu fi proċeduri dijanjostiċi.
1. Żid 80 ml ta' etanol biex iddilwa Buffer GW kif indikat fuq it-tikketta qabel l-użu, aħżen f'temperatura ambjentali.
2. Jekk il-Buffer GDP huwa faċli biex jippreċipita waqt il-ħażna f'temperatura baxxa, jista 'jitqiegħed f'temperatura tal-kamra għal perjodu ta' żmien qabel l-użu.Jekk meħtieġ, jista 'jissaħħan minn qabel f'banju ta' l-ilma ta '37 ℃ sakemm il-preċipitat jinħall kompletament, u mbagħad jista' jintuża wara t-taħlit.
3. Issettja t-temperatura tal-banju ta 'l-ilma għal 50 ~ 55℃ bil-quddiem.
4. Fil-pass 1 tal-programm ta 'estrazzjoni 08-1/Gel, il-minimizzazzjoni tad-daqs tal-porzjon tal-ġel se jnaqqas b'mod sinifikanti l-ħin tat-tidwib u żżid l-effiċjenza tal-irkupru (DNA linearizzat huwa faċilment idrolizza meta espost kontinwament f'temperatura għolja).Tesponix il-ġel tad-DNA għall-UV għal żmien twil, peress li d-dawl ultravjola jista 'jikkawża ħsara lid-DNA.
5. Dewweb il-ġell fil-programm ta 'estrazzjoni 08- 1/Gel pass 2 kompletament, inkella l-effiċjenza ta' rkupru tad-DNA tkun affettwata serjament.
6. Preheat Elution Buffer jew ddH2O sa 55 ℃ , li huwa ta 'għajnuna biex tittejjeb l-effiċjenza ta' l-eluzzjoni tad-DNA.Huwa rakkomandat li tinħażen id-DNA f'eluwent ta' 2.5 mM Tris-HCl, pH 7.0 – 8.5.
