Kit PCR dirett tal-pjanti
Cat Nru: HCR2020A
Plant Direct PCR Kit huwa adattat għall-amplifikazzjoni diretta tal-weraq tal-pjanti, żrieragħ, eċċ., U jista 'jintuża għal screening ta' produzzjoni għolja ta 'kampjuni tal-pjanti li ma fihomx polisakkaridi u polifenoli.Il-polimerażi tad-DNA ta 'amplifikazzjoni diretta bbażata fuq l-evoluzzjoni diretta għandha tolleranza superjuri għall-inibituri tal-PCR fil-pjanti.Sadanittant, iżomm il-prestazzjoni għolja ta 'amplifikazzjoni, li hija adattata għall-amplifikazzjoni ta' frammenti tad-DNA fi ħdan 5 kb.L-uniku Lysis buffer A fil-kit jista 'jintuża biex lyse tessuti tal-pjanti friski jew iffriżati.Huwa faċli biex topera u l-lysate jista 'jintuża bħala mudell għall-amplifikazzjoni mingħajr purifikazzjoni.Is-sistema fiha aġenti protettivi li jippermettu li kampjuni mhux raffinati jiġu amplifikati b'mod effettiv wara ffriżar u tidwib ripetuti.2 × Plant Direct Master Mix jeħtieġ biss li żżid primers u mudelli biex twettaq reazzjoni ta 'amplifikazzjoni, u b'hekk tnaqqas l-operazzjonijiet tal-pipetta u ttejjeb il-fluss ta' sejbien u r-riproduċibilità tar-riżultati.
Komponenti
| Komponenti | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Taħlita Master Diretta tal-Pjanti | 1.25 ml | 4 × 1.25 ml |
| Buffer tal-Liżi Diretta tal-Pjanti A | 5 ml | 20 ml |
| Liżi Diretta tal-Pjanti B* | 5 ml | 20 ml |
*Plant Direct Lysis Buffer B huwa reaġent mhux obbligatorju, li jintuża biex jinnewtralizza l-Plant Direct Lysis Buffer A biex itawwal il-ħin tal-ħażna tal-kampjuni.Jista 'jintuża skond is-sitwazzjoni attwali.
Kundizzjonijiet tal-Ħażna
2 × Plant Direct Master Mix, aħżen fi -30 ~ -15 ℃ u evita l-iffriżar u t-tidwib ripetuti;Plant Direct Lysis Buffer, aħżen fi -30 ~ -15℃ jew 2 ~ 8℃.
Proċess ta 'Esperiment
Ipproċessar tal-Kampjun–Weraq tal-Pjanti
Metodu dirett:Huwa rakkomandat li tuża weraq żgħar.Uża toqba punch b'dijametru fiss ta '0.5 – 3 mm biex tikseb kampjun żgħir u uniformi, u mbagħad żid direttament il-kampjun mas-sistema PCR (sistema ta' 50 μl hija rakkomandata).Innota, kun żgur li l-kampjun ikun fis-soluzzjoni tal-PCR u mhux mal-ħajt tat-tubu.Jekk jintuża PCR dirett biex jamplifika frammenti twal u kampjuni kumplessi, l-użu ta 'kampjun b'dijametru iżgħar (0.5 – 1 mm) bħala mudell jista' jgħin biex jinkisbu riżultati aħjar.
Metodu tal-liżi tat-tħin:Huwa rakkomandat li tuża weraq żgħar.Ħu biċċa werqa żgħira (madwar 1 – 3 mm fid-dijametru), poġġiha f’20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, u itħanha kemm jista’ jkun (dan il-pass jista’ jsir billi tagħfas il-werqa b’ponta tal-pipetta ta’ 100 μl biex maxx il-kampjun).Jekk jintużaw volumi akbar ta 'tessut tal-weraq (ma jaqbżux is-7 mm), żid il-volum tal-buffer tad-dilwizzjoni għal 50 μl.Wara li l-weraq jintaħnu, is-soluzzjoni għandha tidher ħadra.Wara ċentrifugazzjoni qasira, żid 1 μl tas-supernatant mas-sistema PCR bħala mudell ta' reazzjoni.
Metodu tal-liżi termali:Huwa rakkomandat li tuża weraq żgħar.Ħu biċċa żgħira ta 'weraq (madwar 1 – 3 mm fid-dijametru), poġġiha f'20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, u saħħanha f'95 ° C għal 5 – 10 min.Il-ħin tal-liżi jista 'jiġi estiż b'mod xieraq għal weraq li huma diffiċli biex jiġu liżi (mhux aktar minn 20 min).Jekk jintużaw volumi akbar ta 'tessut tal-weraq (ma jaqbżux is-7 mm), żid il-volum tal-buffer tad-dilwizzjoni għal 50 μl.Wara li ssaħħan, ċentrifuga għal ftit żmien, u żid 1 μl ta' supernatant mas-sistema PCR bħala mudell ta' reazzjonib.
Ipproċessar tal-Kampjun–Żerriegħa tal-Pjanti
Metodu tal-liżi tat-tħin:Uża skalpell biex taqta’ żrieragħ b’dijametru ta’ 5 mm, żidhom ma’ 100 μl ta’ Plant Direct Lysis Buffer A, u itħan il-kampjun b’ponta tal-pipetta jew għodda oħra.Vortex fil-qosor u ħalli joqgħod f'temperatura tal-kamra għal 3 – 5 min.Kun żgur li l-kampjun taż-żerriegħa huwa mgħaddas fil-buffer tad-dilwizzjoni.Wara ċentrifugazzjoni qasira, żid 1 μl tas-supernatant mas-sistema PCR bħala mudell ta' reazzjoni.
Metodu tal-liżi termali:Uża skalpell biex taqta żrieragħ b'dijametru ta' 5 mm, żidhom ma' 100 μl ta' Plant Direct Lysis Buffer A, u saħħan f'95°C għal 5 – 10 min.Il-ħin tal-liżi jista 'jiġi estiż b'mod xieraq għal weraq li huma diffiċli biex jiġu liżi (mhux aktar minn 30 min).Wara li ssaħħan, ċentrifuga għal ftit żmien, u żid 1 μl supernatant mas-sistema PCR bħala mudell ta' reazzjonib.
a.Imqass jew għodda oħra jistgħu jintużaw ukoll biex jaqtgħu kampjuni ta 'daqs xieraq;jekk il-punch jew l-imqass jerġgħu jintużaw, għandhom jitnaddfu b'soluzzjoni ta 'ipoklorit tas-sodju ta' 2% qabel kull użu biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni inkroċjata bejn il-kampjuni.
b.Kun żgur li l-Plant Direct Lysis Buffer ikun imdewweb kompletament qabel l-użu.Jekk il-buffer ikun viskuż jew ikollu preċipitati, jista 'jissaħħan f'37 ℃ biex jiddewweb kompletament qabel l-użu.
c.Il-volum tal-mudell fis-sistema ta 'reazzjoni jista' jiġi aġġustat b'mod xieraq skont id-differenza fil-volum tal-materjal tal-pjanti u d-dilwent miżjud.
Buffer tal-Liżi Diretta tal-Pjanti
Il-Buffer A tal-Liżi Diretta tal-Pjanti li jinsab f'dan il-prodott ġie ottimizzat b'mod strett biex jirrilaxxa l-ġenoma tal-biċċa l-kbira tat-tessuti tal-pjanti u huwa adattat għal ħażna għal żmien qasir ta 'pjanti mhux raffinati f'4℃.Jekk il-kampjun jeħtieġ li jinħażen għal perjodu itwal ta 'żmien (eż., 1 – 2 xhur), huwa rakkomandat li s-supernatant jiġi trasferit għal tubu EP ġdid u aħżen f'-20℃.Biex taħżen il-kampjuni b'mod aktar stabbli, żid volum ugwali ta' Plant Direct Lysis Buffer B mas-supernatant trasferit, ħawwad sew u aħżen f'-20℃.Il-ħin tal-ħażna stabbli jvarja skont il-kampjuni u l-istati tal-pjanti.
Sistema ta' Reazzjoni
| ddH2O | Sa 20.0 µl | Sa 50.0 µl |
| 2 × Taħlita Master Diretta tal-Pjantia | 10.0 µl | 25.0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0.8 µl | 2.0 µl |
| Weraq tal-pjanti/kampjun tal-estratt mhux raffinat(Irreferi għall-Ipproċessar tal-Kampjun) | Diska tal-weraq 0.5 – 3 mm/x µl | Diska tal-weraq 0.5 – 3 mm/x µl |
a.Fih Mg2+f'konċentrazzjoni finali ta' 2 mM.
b.Huwa rakkomandat li tuża konċentrazzjoni finali ta '0.4μM għal kull primer.Użu eċċessiv ta 'primers se jwassal għal amplifikazzjoni mhux speċifika akbar.
c.L-ammont ta 'kampjun użat jista' jiġi aġġustat skond is-sitwazzjoni attwali.L-ammont użat f'reazzjoni waħda ta 'kampjun lysed mhux raffinat jista' jiġi aġġustat bejn 2% - 20% tal-volum totali tar-reazzjoni.L-użu ta 'ħafna kampjuni jista' jikkawża falliment ta 'amplifikazzjoni.
Programm ta' Reazzjoni
| Passi | Temperatura | Ħin |
| Denaturazzjoni Inizjali | 98℃ | 5 min |
| Denaturazzjoni | 95℃ | 10 sek |
| Ittemprar | 58 ~ 72℃ | 15 sek |
| Estensjoni | 72℃ | 30 sek |
| Estensjoni Finali | 72℃ | 5 min |
a.Denaturazzjoni Inizjali (98℃, 5 min) tippromwovi l-liżi tat-tessut tal-pjanti, tirrilaxxa DNA ġenomika li tista 'tintuża għall-amplifikazzjoni tal-PCR.Tqassarx il-ħin jew tnaqqas it-temperatura.
b.Huwa rakkomandat li tissettjaha ugwali għall-valur Tm tal-primer jew 2 ~ 4℃ ogħla mill-valur Tm.Il-polimerażi tad-DNA ta 'amplifikazzjoni diretta użata f'dan il-prodott hija differenti minn polimerażi tad-DNA Taq konvenzjonali, u għandha rekwiżiti speċjali għat-temperatura ta' ttemprar tar-reazzjoni; l-użu ta 'temperatura ta' ttemprar għolja jista 'effettivament inaqqas l-amplifikazzjoni mhux speċifika u jtejjeb l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni.Għal mudelli kumplessi, l-amplifikazzjoni effiċjenti tista 'tinkiseb billi tiġi aġġustata t-temperatura tal-ittemprar u tittawwal il-ħin tal-estensjoni.
c.Jekk it-tul tal-prodott ta 'amplifikazzjoni huwa ≤1 kb, il-ħin ta' estensjoni huwa ssettjat għal 30 sek/kb;jekk it-tul tal-prodott ta 'amplifikazzjoni huwa > 1 kb, il-ħin ta' estensjoni huwa ssettjat għal 60 sek/kb.
d.Għal kampjuni kumplessi jew kampjuni b'rendiment baxx ta 'amplifikazzjoni, in-numru ta' ċikli jista 'jiżdied b'mod xieraq għal 40 -50 ċiklu.
Applikazzjonijiet
Huwa applikabbli għall-amplifikazzjoni diretta ta 'tessuti tal-pjanti u screening ta' produzzjoni għolja ta 'kampjuni tal-pjanti li ma fihomx polisakkaridi u polifenoli.
Noti
Għall-użu tar-riċerka biss.Mhux għall-użu fi proċeduri dijanjostiċi.
1. Għall-amplifikazzjoni tal-pjanti mhux raffinati jew l-amplifikazzjoni diretta, huwa rakkomandat li tuża DNA ġenomika purifikata bħala kontroll pożittiv qabel ma jibda l-esperiment biex jiġi żgurat li s-sistema, il-primers u l-operazzjonijiet huma korretti.
2. Il-polimerażi tad-DNA ta 'amplifikazzjoni diretta użata f'dan il-kit għandha attività qawwija ta' qari tal-provi.Jekk il-klonazzjoni TA jeħtieġ li titwettaq, huwa rakkomandat li d-DNA tiġi purifikata qabel ma żżid l-adenina.
3. Gwida tad-Disinn tal-Primer:
a.Huwa rakkomandat li l-aħħar bażi fit-tarf 3′ tal-primer għandha tkun G jew C.
b.Diskrepanzi konsekuttivi għandhom jiġu evitati fl-aħħar 8 bażijiet fit-tarf 3′ tal-primer.c.Evita strutturi hairpin fit-tarf 3′ tal-primer.
d.Id-differenzi fil-valur Tm tal-primer bil-quddiem u l-primer invers m'għandhomx ikunu aktar minn 1 ℃ u l-valur Tm għandu jiġi aġġustat għal 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 huwa rakkomandat li jikkalkula l-valur Tm).
e.Sekwenzi ta' primer addizzjonali addizzjonali li mhumiex imqabbla mal-mudell, m'għandhomx jiġu inklużi meta jiġi kkalkolat il-valur Tm tal-primer.
f.Huwa rakkomandat li l-kontenut tal-GC tal-primer ikun 40% -60%.
g.Id-distribuzzjoni ġenerali ta 'A, G, C u T fil-primer għandha tkun ugwali kemm jista' jkun.Evita li tuża reġjuni b'kontenut għoli ta' GC jew AT.
h.Evita l-preżenza ta’ sekwenzi komplementari ta’ 5 bażijiet jew aktar jew fi ħdan il-primer jew bejn żewġ primers u evita l-preżenza ta’ sekwenzi komplementari ta’ 3 bażijiet jew aktar fit-tarf 3′ ta’ żewġ primers.
i.Uża l-funzjoni NCBI BLAST biex tivverifika l-ispeċifiċità tal-primer biex tevita amplifikazzjoni mhux speċifika.
