Proteinase K NGS (trab)
Cat Nru: HC4507A
NGS Protease K hija serine protease stabbli b'attività ta 'enżima għolja u speċifiċità wiesgħa ta' substrat. L-enżima tiddekomponi preferenzjali bonds ester u bonds peptidi ħdejn is-C-terminal ta 'aċidi amminiċi idrofobiċi, aċidi amminiċi li fihom il-kubrit u aċidi amminiċi aromatiċi.Għalhekk, ħafna drabi jintuża biex jiddegrada proteini f'peptidi qosra.NGS Protease K hija serine protease tipika bl-Asp39-Tiegħu69-Ser224trijade katalitika li hija unika għal serine proteases, u ċ-ċentru katalitiku huwa mdawwar b'irmonk Ca2+siti ta 'rbit għall-istabbilizzazzjoni, iż-żamma ta' attività għolja ta 'enżimi taħt firxa usa' ta 'kundizzjonijiet.
Speċifikazzjoni
| Dehra | Trab amorfu abjad għal offwajt, lajofilizzat |
| Attività speċifika | ≥40U/mg solidu |
| DNase | Xejn misjub |
| RNase | Xejn misjub |
| Bijopiż | ≤50CFU/g solidu |
| Residwu ta' aċidu nuklejku | <5pg/mg solidu |
Proprjetajiet
| Sors | Tritirachium album |
| Numru tal-KE | 3.4.21.64(Rekombinanti mill-album Tritirachium) |
| Piż molekulari | 29kDa (SDS-PAĠNA) |
| Punt iżoelettriku | 7.81 Fig.1 |
| pH ottimali | 7.0-12.0 (Kollha jwettqu attività għolja) Fig.2 |
| Temperatura ottima | 65℃ Fig.3 |
| Stabbiltà tal-pH | pH 4.5-12.5 (25℃,16h) Fig.4 |
| Stabbiltà termali | Taħt 50℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Stabbiltà tal-ħażna | Maħżun f'25℃ għal 12-il xahar Fig.6 |
| Attivaturi | SDS, urea |
| Inibituri | Fluworofosfat diisopropil;fluworidu tal-benżilsulfonil |
Kundizzjonijiet tal-Ħażna
Aħżen it-trab lajofilizzat f'-25 ~ -15 ℃ għal żmien twil 'il bogħod mid-dawl;Wara x-xoljiment, alikwot f'volum xieraq għal ħażna għal żmien qasir f'2-8 ℃ 'il bogħod mid-dawl jew ħażna fit-tul f'-25 ~ -15 ℃ 'il bogħod mid-dawl.
Prekawzjonijiet
Ilbes ingwanti protettivi u gogils meta tuża jew tiżen, u żomm ventilat tajjeb wara l-użu.Dan il-prodott jista 'jikkawża reazzjoni allerġika tal-ġilda u irritazzjoni serja tal-għajnejn.Jekk jittieħed man-nifs, jista 'jikkawża sintomi ta' allerġija jew ażżma jew dispnea.Jista' jikkawża irritazzjoni respiratorja.
Definizzjoni ta' unità
Unità waħda ta 'NGS Protease K hija definita bħala l-ammont ta' enzima meħtieġ biex tidrolizza l-kaseina f'1 μmol L-tyrosine taħt kundizzjonijiet ta 'determinazzjoni standard.
Preparazzjoni tar-reaġenti
| Reaġent | Manifattur | Katalgu |
| Kaseina teknikamill-ħalib tal-ifrat | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 20040618 |
| Aċidu trikloroaċetiku | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 80132618 |
| Aċetat tas-sodju | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 10018818 |
| Aċidu aċetiku | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 10011018 |
| Karbonat tas-sodju | Sinopharm KimikaReaġent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosina | Sigma | 93829 |
Reaġent I:
Substrat: 1% Kaseina minn soluzzjoni tal-ħalib bovin: ħoll 1g kaseina tal-ħalib bovin f'50ml ta 'soluzzjoni ta' fosfat tas-sodju 0.1M, pH 8.0, saħħan f'banju ta 'l-ilma f'65-70 °C għal 15-il minuta, ħawwad u ħoll, kessaħ bl-ilma, aġġustat minn idrossidu tas-sodju għal pH 8.0, u ħallat f'100ml.
Reaġent II:
Soluzzjoni TCA: 0.1M aċidu trikloroaċetiku, 0.2M aċetat tas-sodju u 0.3M aċidu aċetiku (iżen 1.64g aċidu trikloroaċetiku + 1.64g aċetat tas-sodju + 1.724mL aċidu aċetiku suċċessivament, żid 50mL ilma dejonizzat, u aġġusta b'di4lute 03 f'pH. 100ml).
Reaġent III:
Soluzzjoni ta 'karbonat tas-sodju 0.4m (iżen 4.24g karbonat tas-sodju anidru u dewweb f'100mL ilma)
Reaġent IV:
Reaġent tal-fenol Folin: iddilwa 5 darbiet b'ilma dejonizzat.
Reaġent V:
Dilwent ta 'l-enżimi: soluzzjoni ta' fosfat tas-sodju 0.1 M, pH 8.0.
Reaġent VI:
Soluzzjoni standard L-tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml L-tyrosine maħlul b'0.2M HCl.
Proċedura
1. Ixgħel l-ispettrofotometru UV-Vis u agħżel il-kejl fotometriku.
2. Issettja l-wavelength bħala 660nm.
3. Ixgħel il-banju ta 'l-ilma, issettja t-temperatura għal 37℃, żgura li t-temperatura ma tinbidel għal 3-5mins.
4. Saħħan minn qabel 0.5mL substrat f'tubu ċentrifugu ta '2mL f'banju ta' l-ilma ta '37℃ għal 10mins.
5. Oħroġ 0.5mL soluzzjoni ta 'enżima dilwita fit-tubu ċentrifugu msaħħan minn qabel għal 10 minuti.Issettja d-dilwent tal-enżimi bħala grupp vojt.
6. Żid 1.0 mL reaġent TCA immedjatament wara r-reazzjoni.Ħallat sew u inkuba f'banju ta' l-ilma għal 30 minuta.
7. Iċċentrifuga s-soluzzjoni ta 'reazzjoni.
8. Żid il-komponenti li ġejjin fl-ordni speċifikata.
| Reaġent | Volum |
| Supernatant | 0.5 mL |
| Karbonat tas-sodju 0.4M | 2.5 mL |
| Reaġent tal-fenol Folin | 0.5 mL |
9. Ħallat sew qabel l-inkubazzjoni f'banju ta 'l-ilma ta' 37℃ għal 30 minuta.
10. OD660ġie determinat bħala OD1;Grupp ta 'kontroll vojt: Id-dilwent tal-enżimi jintuża biex jissostitwixxi s-soluzzjoni tal-enżimi biex jiddetermina OD660bħala OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Kurva standard L-tyrosine: 0.5mL konċentrazzjoni differenti soluzzjoni L-tyrosine, 2.5mL 0.4M Sodium carbonate, 0.5mL Folin phenol reagent f'5mL tubu ċentrifugu, inkuba f'37℃ għal 30mins, skopri għal OD660għal konċentrazzjoni differenti ta 'L-tyrosine, imbagħad kiseb il-kurva standard Y=kX+b,fejn Y hija l-konċentrazzjoni L-tyrosine, X hija OD600.
Kalkolu
2: Volum totali ta 'soluzzjoni ta' reazzjoni (mL)
0.5: Volum ta 'soluzzjoni ta' enzima (mL)
0.5: Volum tal-likwidu tar-reazzjoni użat fid-determinazzjoni kromoġenika (mL)
10: Ħin ta' reazzjoni (min)
Df: Dilwizzjoni multipla
C: Konċentrazzjoni tal-enzima (mg/mL)
Figuri
Fig.1 Residwu tad-DNA
| Kampjun | Ave C4 | Aċidu Nuklejku Irkupru (pg/mg) | Irkupru (%) | Nukleiku Totali Aċidu ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| Ħieles mill-RNA H2O | Mhux determinat | — | — | — |
Fig.2 pH ottimali
Fig.3 Temperatura ottima
Fig.4 Stabbiltà tal-pH
Fig.5 Stabbiltà termali
Fig.6 Stabbiltà tal-ħażna f'25℃
