RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase hija polimerażi tad-DNA li tiddependi mill-mudell ta' RNA li m'għandhiex l-attività ta' exonuclease 3'→5' u għandha attività RNase H.Din l-enzima tista 'tuża RNA bħala mudell biex tisintetizza linja komplementari ta' DNA, li tista 'tiġi applikata għas-sintesi ta' cDNA tal-ewwel linja, speċjalment għal RT-LAMP (amplifikazzjoni iżotermika medjata minn loop).Meta mqabbel ma 'RTL reverse transcriptase 1.0, is-sensittività hija mtejba b'mod sinifikanti, l-istabbiltà termali hija aktar b'saħħitha, u r-reazzjoni f'65 ° C hija aktar stabbli.RTL reverse transcriptase (free glycerol) jista 'jintuża biex jipprepara preparazzjonijiet lajofilizzati, reaġenti RT-LAMP lajofilizzati eċċ.
Definizzjoni ta' Unità
Unità waħda tinkorpora 1 nmol ta 'dTTP f'materjal li jista' jiġi preċipitat bl-aċidu f'20 minuta f'50°C billi tuża poly(A)•oligo(dT)25 bħala template-primer.
Komponenti
| Komponent | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Mingħajr gliċerol) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10 × HC RTL Buffer | 1.5 mL | 4 × 1.5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 mL | 3 × 10 mL |
Kundizzjoni tal-Ħażna
Trasport taħt 0°C u jinħażen f'-25°C~-15°C.
Kontroll tal-Kwalità
- Attività Residwu ta'Endonukleażi:Reazzjoni ta '50 μL li fiha 1 μg ta' λDNA u 15-il unità ta 'RTL2.0 inkubata għal 16-il siegħa f'37 ℃ turi l-istess mudell bħal kontroll negattiv permezz ta' elettroforeżi tal-ġel.
- Attività Residwu ta'Exonuclease:Reazzjoni ta '50 μL li fiha 1 μg ta' λDNA diġerit Hind Ⅲ u 15-il unità ta 'RTL2.0 inkubati għal 16-il siegħa f'37 ℃ turi l-istess mudell bħal kontroll negattiv permezz ta' elettroforeżi tal-ġel.
- Attività Residwu ta'Nickase:Reazzjoni ta '50 μL li fiha 1 μg ta' pBR322 supercoiled u 15-il unità ta 'RTL2.0 inkubati għal 4 sigħat f'37 ° C turi l-istess mudell bħal kontroll negattiv permezz ta' elettroforeżi tal-ġel.
- Attività Residwu ta'RNase:Reazzjoni ta '10 μL li fiha 0.48 μg ta' MS2 RNA u 15-il unità ta 'RTL2.0 inkubati għal 4 sigħat f'37 ° C turi l-istess mudell bħal kontroll negattiv permezz ta' elettroforeżi tal-ġel.
- E. coli gDNA:Imkejla biE.colikits speċifiċi ta 'skoperta ta' HCD, 15-il unità ta 'RTL2.0 fihom inqas minn 1E. coliġenoma.
Setup tar-Reazzjoni
Protokoll ta' Sinteżi cDNA
| Komponenti | Volum |
| Mudell RNA a | fakultattiv |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50uM) jew taħlita ta 'Primer każwali (60uM) | 2 μL |
| Ħallat dNTP (10mM kull wieħed) | 1 μL |
| Inibitur RNase (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μL |
| Ilma mingħajr nukleażi | Sa 20 μL |
Noti:
1) Id-dożaġġ rakkomandat ta 'RNA Totali huwa 1ng ~ 1μg
2) Id-dożaġġ rakkomandat ta 'mRNA kien 50ng ~ 100ng
Termo-ċikliżmu Kundizzjonijiet għal rutina reazzjoni:
| Temperatura (°C) | Ħin |
| 25 °Ca | 5mins |
| 55 °C | 10 minutib |
| 80 °C | 10 minuti |
Noti:
1) Jekk tintuża Random Primer Mix, pass ta' inkubazzjoni f'25°C.
2) Jekk tintuża taħlita ta 'primer fil-mira, pass ta' inkubazzjoni f'55 ° C għal 10 ~ 30 minuta.
Protokoll RT-LAMP
| Komponenti | Volum | Konċentrazzjoni Finali |
| Mudell RNA | fakultattiv | ≥10 kopji |
| Ħallat dNTP (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP/BIP Primers (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primers (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primers (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| Inibitur RNase (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reazzjoni |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Reazzjoni |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reazzjoni |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (jew 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Ilma mingħajr nukleażi | Sa 25 μL | - |
Noti:
1) Ħallat bil-vortex u ċentrifuga fil-qosor biex tiġbor.Inkubazzjoni b'temperatura kostanti f'65°C għal siegħa.
2) Iż-żewġ buffers huma interoperabbli u għandhom l-istess kompożizzjoni.
Noti
1.Dan il-prodott se jifforma solidu abjad meta jinħażen f'-20 °C.Oħroġ minn -20°C u poġġiha fuq is-silġ għal madwar 10 minuti.Wara li jdub, jista 'jintuża billi tħawwad u titħallat.
2.Il-prodott cDNA jista 'jinħażen f'-20 °C jew -80 °C jew jintuża immedjatament għal reazzjoni PCR.
3.Biex tevita l-kontaminazzjoni ta 'RNase, jekk jogħġbok żomm iż-żona sperimentali nadifa, u ilbes ingwanti u maskri nodfa waqt it-tħaddim.
