Uracil DNA Glycosylase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG jew UDG) huwa klonu rikombinanti ta 'E.coli b'piż molekulari ta' 25 kDa.Jikkatalizza r-rilaxx ta 'uracil ħieles minn DNA bi strand wieħed u double stranded li fih l-uracil, u huwa inattiv kontra l-RNA, u jista' jintuża biex jipprevjeni l-kontaminazzjoni ta 'prodotti ta' amplifikazzjoni PCR.Il-prinċipju ta 'azzjoni huwa bbażat fuq il-fatt li jekk id-dUTP jiġi sostitwit għal dTTP fir-reazzjoni tal-PCR u jiġi ffurmat prodott ta' amplifikazzjoni tal-PCR li jkun fih bażijiet dU, l-enzima tista 'tkisser b'mod selettiv ir-rabta glikosidika tal-bażijiet U f'linja waħda u b'żewġ linji. DNA u jiddegrada l-prodott ta 'amplifikazzjoni PCR.
Applikazzjoni Rakkomandata
Amplifikazzjoni tal-Prevenzjoni tal-Kontaminazzjoni
Kundizzjoni tal-Ħażna
-20 ° C għal ħażna fit-tul, għandhom jitħalltu sew qabel l-użu, jevitaw frekwenti iffriżar-tidwib.
Buffer tal-ħażna
20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabbilizzatur, 50% Glycerol.
Definizzjoni ta' Unità
L-ammont ta' enzima meħtieġ biex tiddegrada 1µg ta' DNA single-stranded li jkun fih bażijiet dU f'siegħa f'temperatura ta' 37°C huwa 1 unità.
Kontroll tal-Kwalità
1.Purità elettroforetika SDS-PAGE akbar minn 98%
2.Sensittività ta 'amplifikazzjoni, kontroll minn lott għal lott, stabbiltà
3.Wara li 1U ta' UNG jiġi ttrattat f'50 ℃ għal 2 minuti, il-mudell li jkun fih U taħt 103 kopji għandu jiġi degradat kompletament u ma jista' jiġi prodott l-ebda prodott ta' amplifikazzjoni
4.L-ebda attività nukleażi eżoġena
Istruzzjonijiet
| Komponenti | Volum (μL) | Konċentrazzjoni finali |
| 10 × PCR Buffer (ħieles minn dNTP, Mg²+b'xejn) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (issostitwixxi dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0.25 U (0.1-0.5) |
| 25 × Primer Taħlitaa | 2 | 1× |
| Mudell | - | ＜1μg/reazzjoni |
| ddH₂O | Sa 50 | - |
Nota: a: Jekk tintuża għal qPCR/qRT-PCR, is-sonda fluworexxenti għandha tiżdied fis-sistema ta 'reazzjoni.Normalment, konċentrazzjoni ta 'primer finali ta' 0.2 μM tista 'tagħti riżultati tajbin;meta l-prestazzjoni tar-reazzjoni tkun fqira, il-konċentrazzjoni tal-primer tista 'tiġi aġġustata fil-medda ta' 0.2-1 μM.Normalment, il-konċentrazzjoni tas-sonda hija ottimizzata fil-medda ta '0.1-0.3 μM.Jistgħu jsiru esperimenti ta 'gradjent ta' konċentrazzjoni biex tinstab l-aħjar kombinazzjoni ta 'primer u sonda.
Noti
1.L-enzima UNG tista 'tintuża biex tneħħi l-prodotti ta' amplifikazzjoni dUTP kontaminati mis-sistema ta 'reazzjoni qabel ir-reazzjoni ta' amplifikazzjoni tal-PCR, imbagħad biex jiġu evitati riżultati pożittivi foloz minħabba l-kontaminazzjoni tal-prodott.
2.It-temperatura ottimali għall-enzima UNG biex tintuża fir-reazzjoni tal-PCR kontra l-kontaminazzjoni hija ġeneralment 50℃ għal 2mins;il-kundizzjoni ta 'inattivazzjoni hija 95 ℃ għal 5 minuti.
3.Evita friża-tidwib frekwenti, u tesponix għal varjazzjonijiet kbar fit-temperatura.
4.Ġeni differenti li għandhom jiġu amplifikati għandhom effiċjenza ta 'utilizzazzjoni differenti ta' dUTP u sensittività għall-enzima UNG, għalhekk, jekk l-użu tas-sistema UNG iwassal għal tnaqqis fis-sensittività ta 'skoperta, is-sistema ta' reazzjoni għandha tiġi aġġustata u ottimizzata, jekk għandek bżonn appoġġ tekniku, jekk jogħġbok ikkuntattja kumpanija tagħna.
