2×Sensi Direct Premix-UNG (Sonda qPCR)
Cat Nru: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) huwa ddisinjat biex iwettaq PCR direttament minn kampjuni mingħajr estrazzjoni tad-DNA jew preparazzjoni tal-kampjun.Dan ir-reaġent jikkonsisti minn hot-start DNA polymerase, uracil DNA glycosylase (UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTPs (b'dUTP minflok dTTP), u stabilizzaturi, għal PCR kwantitattiv (qPCR).Dan ir-reaġent jippreforma tolleranza għolja ta 'inibitur, u għalhekk jista' jiġi applikat direttament għall-iskoperta ta 'kampjuni bħal swab tal-griżmejn, bżieq, demm sħiħ anti-koagulat, plażma, u serum mingħajr estrazzjoni tad-DNA.Ir-reaġent juża buffer proprjetarju għal qPCR b'enzimi mħallta ta 'polimerażi tad-DNA anti-inibitorja u enzima UNG.Għalhekk, jista 'jikseb amplifikazzjoni tajba tal-ġeni fil-mira f'kampjuni li jkun fihom inibituri u jinibixxi amplifikazzjoni pożittiva falza kkawżata minn residwu tal-PCR u tniġġis tal-ajrusol.Dan ir-reaġent huwa kompatibbli mal-biċċa l-kbira tal-istrumenti PCR kwantitattivi fluworexxenti, bħal Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche eċċ.
Komponenti
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Kundizzjonijiet tal-ħażna
Il-komponenti kollha għandhom jinżammu f'-20℃ għal ħażna fit-tul u 4℃ sa 3 xhur.Jekk jogħġbok ħallat sewwa wara li tinħall u ċċentrifuga qabel tuża.Evita l-iffriżar u t-tidwib frekwenti.
Protokoll taċ-ċikliżmu
| Pass | Temperatura | Ħin | Ċiklu |
| Diġestjoni | 50℃ | 2min | 1 |
| Attivazzjoni tal-polimerażi | 95℃ | 1-5min | 1 |
| Denaturazzjoni | 95℃ | 10-20s | 40-50 |
| Ittemprar/Estensjoni | 56-64℃ | 20-60s |
Istruzzjonijiet tal-pipettar
| Reaġent | Volum għal kull reazzjoni | Volum għal kull reazzjoni | Konċentrazzjoni Finali |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12.5µL | 25µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0.5µL | 1µL | 1× |
| 25 × Taħlita tal-Primer-Probe1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Kampjun3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volum totali | 25 μL | 50 μL | - |
1. Il-konċentrazzjoni finali tal-primer hija ġeneralment 0.2μM.Għal riżultati aħjar, il-konċentrazzjoni tal-primer tista 'tiġi ottimizzata fil-medda ta' 0.2-1μM.
2. Ġeneralment, il-konċentrazzjoni tas-sonda tista 'tiġi ottimizzata fil-medda ta' 0.1-0.3μM.Il-konċentrazzjoni ottimali ta 'theprobe hija relatata ma' l-istrument ta 'amplifikazzjoni PCR fil-ħin reali, it-tip ta' sonda, u t-tip ta 'sustanza ta' tikkettjar fluworexxenti.Jekk jogħġbok irreferi għall-manwal tal-istrument jew ir-rekwiżiti speċifiċi ta 'kull sonda fluworexxenti.
3. Tipi differenti ta 'kampjuni fihom tipi differenti u kontenut ta' inibitur u numru ta 'kopja tal-ġene fil-mira.Il-volum tal-kampjun għandu jiġi kkunsidrat mill-kondizzjoni attwali.Agħmel dilwizzjoni tal-kampjun billi żżid ilma mingħajr nukleażi jew TE Buffer, jekk meħtieġ.
4. Volum rakkomandat ta 'kampjuni differenti:
| Kampjun | Volum għal 50 wieħed μL reazzjoni | Massimu proporzjon |
| Demm sħiħ antikoagulat | 2.5 μL | 5% |
| Plażma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Tampun tal-gerżuma | 10 μL | 20% |
| Bżieq | 10 μL | 20% |
Kontroll tal-Kwalità
1. Sejbien tal-funzjoni: sensittività, speċifiċità u ripetibbiltà tal-qPCR.
2. L-ebda attività nukleażi eżoġena: l-ebda tniġġis eżoġenu ta 'endonuclease u exonuclease.
Noti tal-Prodott
1. Dan il-prodott juża tip ġdid ta 'polimerażi tad-DNA hot-start, li tista' tiġi attivata f'1-5 minuti. Peress li l-buffer ta 'reazzjoni tiegħu ġie ottimizzat, huwa aktar adattat għal PCR kwantitattiv ta' fluworexxenza doppja jew multipla bl-użu tal-metodu ta 'sonda.
2. Jekk il-valur Rn tal-amplifikazzjoni tal-PCR huwa baxx wisq jew l-amplifikazzjoni hija ovvjament inibita, tnaqqis fl-ammont tal-kampjun, żieda fil-volum ta 'reazzjoni jew dilwizzjoni preċedenti tal-kampjun jistgħu jtejbu r-riżultati.
3. Il-ġbir ta 'demm, bżieq, awrina, swab tal-griżmejn, eċċ għandhom isegwu r-rekwiżiti tal-kriterji kliniċi, u kampjun frisk jista' jintuża biex jipprevjeni d-degradazzjoni tal-aċidu nuklejku.
4. Peress li amplicons differenti għandhom effiċjenza ta 'utilizzazzjoni differenti għal dUTP u sensittività għal UNG, ir-reaġenti għandhom jiġu ottimizzati jekk is-sensittività ta' skoperta tonqos meta tuża s-sistema UNG.Jekk jogħġbok ikkuntattjana għal appoġġ tekniku jekk meħtieġ.
5. Biex tiġi evitata l-amplifikazzjoni ta 'prodotti PCR ta' riport bejn reazzjonijiet f'pass wieħed, żona sperimentali dedikata u pipetta huma meħtieġa għall-amplifikazzjoni.Oħdem bl-ingwanti u ibdel ta 'spiss u ma tiftaħx it-tubu ta' reazzjoni wara l-amplifikazzjoni tal-PCR.
