Proteinase K mNGS (likwidu)
Proteinase K hija serine protease stabbli b'ispeċifiċità wiesgħa ta 'sottostrat.Jiddegrada ħafna proteini fl-istat nattiv anke fil-preżenza ta 'deterġenti.Evidenza minn studji dwar l-istruttura tal-kristall u molekulari tindika li l-enzima tappartjeni għall-familja tas-subtilisin bi trijade katalitika tas-sit attiv (Asp39-Tiegħu69-Ser224).Is-sit predominanti tal-qsim huwa r-rabta peptide ħdejn il-grupp karbossiliku ta 'aċidi amminiċi alifatiċi u aromatiċi b'gruppi alfa amino imblukkati.Huwa komunement użat għall-ispeċifiċità wiesgħa tiegħu.Din il-proteinażi K hija ddisinjata apposta għall-mNGS.Meta mqabbel mal-proteinażi K l-oħra, fih saħansitra inqas kontaminazzjoni ta 'aċidu nuklejku bl-istess prestazzjoni enżimatika, li tista' tiżgura aħjar l-applikazzjoni mNGS downstream.
Kundizzjonijiet tal-Ħażna
2-8℃ għal sentejn
Speċifikazzjoni
| Dehra | Likwidu bla kulur għal kannella ċar |
| Attività | ≥800 U/ml |
| Konċentrazzjoni tal-proteina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Xejn misjub |
| DNase | Xejn misjub |
| RNase | Xejn misjub |
Proprjetajiet
| Numru tal-KE | 3.4.21.64(Rekombinanti mill-album Tritirachium) |
| Punt iżoelettriku | 7.81 |
| pH ottimali | 7.0- 12.0 Fig. 1 |
| Temperatura ottima | 65 ℃ Fig. 2 |
| Stabbiltà tal-pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Stabbiltà termali | Taħt 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Stabbiltà tal-ħażna | Aktar minn 90% attività għal 12-il xahar f'25 ℃ |
| Attivaturi | SDS, urea |
| Inibituri | Fluworofosfat diisopropil;fluworidu tal-fenilmetilsulfonil |
Applikazzjonijiet
1. Kit dijanjostiku ġenetiku
2. Kits ta 'estrazzjoni ta' RNA u DNA
3. Estrazzjoni ta 'komponenti mhux proteini mit-tessuti, degradazzjoni ta' impuritajiet ta 'proteini, bħal DNAvaċċini u preparazzjoni ta' eparina
4. Preparazzjoni tad-DNA tal-kromożomi b'elettroforeżi pulsata
5. Western blot
6. Reaġenti tal-albumina glycosylated enżimatiċi dijanjosi in vitro
Prekawzjonijiet
Ilbes ingwanti protettivi u gogils meta tuża jew tiżen, u żomm ventilat tajjeb wara l-użu.Dan il-prodott jista 'jikkawża reazzjoni allerġika tal-ġilda u irritazzjoni serja tal-għajnejn.Jekk jittieħed man-nifs, jista 'jikkawża sintomi ta' allerġija jew ażżma jew dispnea.Jista' jikkawża irritazzjoni respiratorja.
Definizzjoni ta' unità
Unità waħda (U) hija definita bħala l-ammont ta' enzima meħtieġ biex tiġi idrolizzata l-kaseina biex tipproduċi 1 μmoltyrosine kull minuta taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin.
Preparazzjoni tar-reaġenti
Reaġent I: 1g kaseina tal-ħalib ġiet maħlula f'50ml ta 'soluzzjoni ta' fosfat tas-sodju 0.1M (pH 8.0), inkubata f'ilma 65-70 ℃ għal 15-il minuta, imħawda u maħlula, imkessħa bl-ilma, aġġustata bl-idrossidu tas-sodju għal pH 8.0, u volum fiss 100ml.
Reaġent II: aċidu trikloroaċetiku 0.1M, aċetat tas-sodju 0.2M, aċidu aċetiku 0.3M.
Reaġent III: 0.4M Na2CO3soluzzjoni.
Reaġent IV: Reaġent Forint dilwit b'ilma pur għal 5 darbiet.
Reaġent V: Dilwent ta 'l-enżimi: soluzzjoni ta' fosfat tas-sodju 0.1M (pH 8.0).
Reaġent VI: soluzzjoni tat-tyrosine: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine maħlul b'0.2M HCl.
Proċedura
1. 0.5ml ta' reaġent I jissaħħan minn qabel għal 37℃, żid 0.5ml ta' soluzzjoni ta' enżima, ħawwad sew, u inkuba f'37℃ għal 10 minuti.
2. Żid 1ml tar-reaġent II biex twaqqaf ir-reazzjoni, ħawwad sew, u kompli l-inkubazzjoni għal 30 minuta.
3. Iċċentrifuga s-soluzzjoni ta 'reazzjoni.
4. Ħu 0.5ml supernatant, żid 2.5ml reaġent III, 0.5ml reaġent IV, ħawwad sew u inkuba f'37℃għal 30 minuta.
5. OD660ġie determinat bħala OD1;Grupp ta 'kontroll vojt: 0.5ml reaġent V jintuża biex jissostitwixxi l-enzimasoluzzjoni biex tiddetermina OD660bħala OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Kurva standard L-tyrosine: 0.5mL konċentrazzjoni differenti soluzzjoni L-tyrosine, 2.5mL Reaġent III, 0.5mL Reaġent IV f'tubu ċentrifugu 5mL, inkuba f'37℃ għal 30mins, skopri għal OD660għal konċentrazzjoni differenti ta 'L-tyrosine, imbagħad kiseb il-kurva standard Y=kX+b, fejn Y hija l-konċentrazzjoni L-tyrosine, X hija OD600.
Kalkolu
2: Volum totali ta 'soluzzjoni ta' reazzjoni (mL)
0.5: Volum ta 'soluzzjoni ta' enzima (mL)
0.5: Volum tal-likwidu tar-reazzjoni użat fid-determinazzjoni kromoġenika (mL)
10: Ħin ta' reazzjoni (min)
Df: Dilwizzjoni multipla
C: Konċentrazzjoni tal-enzima (mg/mL)
Referenzi
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Riż.Komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Klonazzjoni Molekulari: Manwal tal-Laboratorju, it-2 edizzjoni, Cold Spring HarborPress tal-Laboratorju, Cold Spring Harbour (1989).
Figuri
Fig.1 Ottimu pH
Soluzzjoni buffer 100mM:pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konċentrazzjoni ta 'enżima: 1mg/mL
Fig.2 Temperatura ottima
Reazzjoni f'20 mM K-phosphate buffer pH 8.0.Konċentrazzjoni tal-enzima: 1 mg/mL
Fig.3 pH Stabbiltà
25 ℃, trattament ta '16 h b'soluzzjoni buffer 50 mM: pH 4.5- 5.5, Aċetat;pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0- 12.5, Glycine-NaOH.Konċentrazzjoni tal-enzima: 1 mg/mL
Fig.4 Termali stabbiltà
30 min-trattament b'50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.Konċentrazzjoni tal-enzima: 1 mg/mL
Fig.5 Ħażna stability at 25℃
